Va ser fundada el 31 gener 1676 pel Reial Cèdula de Carlos II, sent la quarta Universitat fundada en Amèrica. Els pensadors més importants de la història de Guatemala s'han format en aquest centre d'estudi. Essent la Universitat de San Carlos l’única Universitat pública a Guatemala, s’ha convertit també en la més important. En l’època de la revolució guatemalenca es va establir la seva total autonomia, arribant a nivell constitucional. La transcendència dels seus estudiants i d’ella mateixa s'ha vist reflectida en diferents èpoques d'importància, des de la independència de Guatemala, la revolució de 1944, el conflicte armat guatemalenc i fins a la data d’avui. Les primeres càtedres de la Universitat de San Carlos van ser: Teologia escolàstica, Teologia moral, Cànons, Lleis, Medicina i dos cursos de llengües.
Aquell mateix any (1676), s’inicia la primera protesta estudiantil, protagonitzada els primers alumnes de Lleis i Dret canònic, perquè els professors nomenat de forma interina no comença les classes i el 3 de febrer de 1681 demanen a les autoritats universitàries el nomenament del Llicenciat Antonio Oávila Quiñonez per a la Càtedra de dret, la qual cosa s’autoritza el febrer d'aquell any.
La constitució universitària exigia la llibertat de càtedra, i també obligava a llegir doctrines filosòfiques contràries per motivar la dialèctica i la discussió d'idees.